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百瑞极——酵母双杂那点事

关于酵母双杂


历史


酵母双杂交系统,又称蛋白阱捕获系统,是由Fields和 Song等人根据真核转录调控的特点创建的。利用酵母双杂交系统能够快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用,并能寻找、分离与已知蛋白相互作用的配体,在研究抗原和抗体相互作用、发现新的蛋白质和发现蛋白质的新功能、筛选药物作用位点及药物对蛋白互作影响、建立基因组蛋白连锁图等方面应用广泛。


原理


酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识。真核生物中基因转录需要转录激活因子的参与,真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域。转录因子通常含有两个独立的结构域:DNA结合域(BD)和转录激活域(AD),只有当这两种结构域共同作用时才能使转录正常进行。


利用此特性,可以分别使BD与AD同“诱饵”蛋白(X)和“猎物”蛋白(Y)形成融合蛋白,一般把用来进行筛选的目的蛋白称为“诱”蛋白,而筛到的阳性克隆称为“猎物”蛋白。单独的BD与AD蛋白质游离于细胞中不同的位置而分开,不能激活报告基因的转录。如果两种蛋白X和Y可以发生相互作用,就能使BD与AD在空间上充分接近,从而激活报告基因的转录。判断通过报告基因表达与否,即可判断两蛋白之间是否存在相互作用




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图1:酵母双杂交原理


判断互作


如何判断是否存在相互作用?

报告基因作为一种营养标记,常用的有HIS3,URA3,LacZ和ADE2等,对应的宿主菌则是相应标记的缺陷型细胞,必须要在含有该营养标记的培养基中生长。因此,当有相互作用的蛋白存在时,激活报告基因的表达,从而能够在不含营养标记的培养基中生长,以此验证是否存在相互作用。


组成部分



酵母双杂交系统由三个重要元件组成:

与DNA结合结构域(BD)融合的蛋白表达载体(BD-X),被表达的蛋白称为诱饵蛋白(bait)或称为诱饵,通常诱饵蛋白为已知蛋白。


与转录激活结构域(AD)融合的蛋白表达载体(AD-Y),被其表达的蛋白称为靶蛋白(prey)或称为猎物,靶蛋白可以为cDNA文库、基因片段或基因突变体等。


带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3,URA3,LacZ和ADE2等,而菌株则需具有相应的缺陷型(如果报告基因为HIS3,则菌株应为HIS3的缺陷型。双杂交质粒上带有特定的抗性基因和营养标记),一个菌株可以含有1个、2个或多个报告基因。


应用


(1) 检验一对已知蛋白(或结构域)间的相互作用;

(2) 用已知功能的蛋白基因筛选 cDNA 文库,寻找互作蛋白,根据钓到的基因功能推测该新基因作用网络。


酵母双杂交系统主要应用于快速验证已知蛋白之间的相互作用或寻找新的相互作用蛋白质,尤其在寻找蛋白质互作区域时相当有优势。

其优点有:

(1)采用高拷贝和强启动子的表达载体使目的蛋白过量表达,方便复合物的形成;

(2)筛选过程在真核酵母活细胞内进行,一定程度上反映了体内的真实情况;

(3)检测的结果是基因表达产物的级联效应,通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用,而细胞内的免疫共沉淀依赖于两个互作蛋白质的解离程度,因为在免疫沉淀的过程中通过洗涤的过程降低了互作信号;

(4)文库来源广泛,可采用不同组织、器官、细胞类型和特殊分化时期材料构建成cDNA文库。


缺点有:目前的酵母双杂交方法存在操作复杂,假阳性和假阴性多,结果主要为定性数据,不易精确判断蛋白质相互作用的强度等问题。酵母双杂交结果需要再用其他方法进行进一步确认。


实验流程



以GaL4系统为例的酵母双杂实验流程

1. 挑活化好的酵母菌株AH109单克隆,接种于5 mL YPDA液体培养基中。

2. 30℃,250 rpm,培养16-18 h。

3. 按每个反应10 mL的菌量计算所需的培养基体积。将过夜培养物转接入适量的YPDA液体培养基,30℃,250 rpm,培养至OD600为0.4-0.6。在30℃时,酵母约为2.5 h一代,可据此计算接入的菌量。

4. 开始收集菌体时,准备变性鲑精DNA。沸水浴中煮10 min,随后立即插冰上备用。

5. 将培养好的细胞转入50 mL离心管中。室温,4000 rpm,5 min,收集细胞。

6. 弃上清,1/2体积无菌水重悬菌体。

7. 室温,4000 rpm,5 min,收集细胞。弃上清,用1/5体积1×TE/LiAC重悬。

8. 室温,4000 rpm,5 min,收集细胞。弃上清,用1/100体积1×TE/LiAC重悬。

9. 30℃,200 rpm,培养30 min(可缩短或取消)。

10. 准备转化的质粒:将1 μg质粒DNA(共转化时,两种质粒各为1 μg)及2 μL 10 mg/mL的变性鲑精DNA加入2 mL离心管中,充分混匀,总体积不应超过10 μL。

11. 加入100 μL酵母感受态细胞并轻轻混匀,30℃,200 rpm,培养30 min(可缩短或取消)。

12. 加入600 μL PEG/LiAC溶液(40% PEG,1×LiAC,1×TE)。轻轻吹打混匀。30℃,200 rpm,培养30 min-90 min。

13. 加入70 μL DMSO,轻轻颠倒混匀。

14. 42℃水浴中热激10 min。冰上放置2 min。

15. 室温,4000 rpm,离心2 min。弃上清,加100 μL无菌水重悬细胞。

16. 将细胞悬液各取一半涂于SD/-Trp-Leu和SD/- Trp-Leu- Ade-His平板上。

17. 28℃培养一周后观察并拍照。



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