为什么要使用酵母表达系统来进行蛋白质互作研究?

酵母可以提供一个体内真核系统，同时又兼具原核细菌系统的可操作性强、简单易用的优点。在酵母体内表达的蛋白质可以正确的折叠；提供中性pH内部环境；可以形成二硫键和其他真核系统共有的翻译后修饰。这些特点对于维持天然蛋白结构获得真实的蛋白质互作关系至关重要。同时，酵母可操作性强，并且已进行全基因组测序。利用同源重组可以很方便地直接在酵母中构建文库。

用于酵母双杂交筛选的bait蛋白质有什么要求?

Bait蛋白质应该是核蛋白质或胞浆蛋白质；分泌型蛋白质不能用作bait;通常来讲，bait不能带有跨膜结构域；bait和prey的互作不能依赖于糖基化，这是由于酵母翻译后修饰不包括糖基化；bait与GAL4 BD域融合表达后可以正确的折叠；bait不能激活酵母中转录报告基因的表达(即不能有自激活活性)。

以经验来看，bait不宜过大，过大的外源性融合蛋白在酵母中不稳定，我们推荐bait不超过100 kD,或bait载体的DNA插入片段不超过3kb。大多数情况下，bait的设计依赖于经验，很难确定bait的效果会如何。酵母杂交中插入片段的N端与147个氨基酸的GAL4 BD融合表达，这可能会影响蛋白折叠，以及插入的结构域能否进行蛋白质互作。比较大的bait可能会引起非特异性互作而提高背景，推荐使用较小的、特异的bait进行酵母双杂交实验。小至8个氨基酸，大至750个氨基酸的蛋白都已经被成功用于酵母双杂交研究。

做酵母mating实验的最佳时间是多久?需要注意什么?

酵母mating实验一般需要20-24小时。我们推荐通过检测到显微镜下的三叶草结构作为酵母接合反应成功的根据，一般的酵母接合效率为2-5%左右。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数，提高杂交效率。进行mating实验时，需要低速摇菌30-50 rpm条件下培养，20 h后显微镜下观察是否有接合反应发生，若没有继续培养4 h。

酵母双杂交可以用两种质粒共转化一个菌株进行蛋白相互作用的筛选吗，与接合反应相比较哪个效果好?

可以将两种质粒共转化Y2H Gold菌株进行蛋白相互作用的筛选，但这种方式的实验操作转化效率不好控制，稳定性不好。利用酵母菌有性生殖的过程，采用两种不同类型的菌株(Y187和Y2H Gold),通过它们之间的有性接合反应进行筛选，筛选方式很科学，假阳性率低。

使用Matchmaker系统做酵母双杂交，转化效率很低(没有做对照实验),这是什么原因?

建议先做对照实验；DNA质量一定要高，可以用乙醇再次纯化；DMSO和Carrier DNA质量要高，最好是新鲜的，Carrier DNA在转化之前最好用沸水变性；SD培养基pH值应调为5.8,YPDA应调为6.5。重新配制培养基，检测对照的转化效率；可能是BD载体翻译出来的融合蛋白质对酵母菌有毒性。

一般来说，保存于25%甘油的酵母菌株在每次解冻后会丢失10%的活力细胞。因此，大多数冻存的酵母在融化温度不超过室温而且操作小心的条件下，最多可容忍10次冻融。有两个例外情况请注意：预制的酵母文库和酵母感受态细胞。为筛选到基因覆盖度最广的文库，预制的酵母文库一旦解冻，就必须立即使用且不要重新冻存。同样，为得到最高转化效率，酵母感受态细胞应该立即使用且避免冻存。

什么是均一化处理，为什么要进行均一化处理?

均一化文库是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。在均一化cDNA文库中，高丰度基因与低丰度基因均衡，这就避免了在筛选的过程中由于基因组本身基因丰度的高低而影响到筛选概率的问题，因此这样的文库具有更高的基因代表性。使用双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN),降解杂交过程中形成的双链DNA。高丰度的基因形成双链的速度较快，所以降解也比较多，从而达到均一化的目的。

不可以，X-Gal与X-Alpha-Gal不同。X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶(LacZ)的反应底物，而X-Alpha-Gal是酵母α-半乳糖苷酶(Mel1p)的反应底物。X-Alpha-Gal在Matchmaker Gold系统中用作蓝白筛选的筛选底物，在蛋白质互作激活mel1基因表达后，酵母细胞可以分泌表达Mel1p。

在两缺培养基上长出墨绿色的菌落，是否正常?

正常情况下在添加了X-α-gal的双缺平板上如果有蓝色的菌落长出，说明研究的两个蛋白间有阳性的相互作用，如果菌落是白色的说明研究的两个蛋白没有相互作用。出现墨绿色的菌落是一种比较少见的现象，也认为是有阳性作用，出现这种颜色上的差异，可能是受酵母代谢产物的影响。对于这种情况，建议在双缺的平板上挑取单菌落，在四缺平板上划线，通过多次划线的方式进一步确定蛋白间的阳性相互作用。

灭菌时温度过高，培养基碳化会导致颜色发黑，需要保证在121℃,15 min高压条件下灭菌。

为什么酵母菌在培养基上培养有时会变成粉红色或红色?

ADE2或ADE1菌株在低含量腺嘌呤培养基上生长时，嘌呤前体积累造成菌株变红。百瑞极的YPDA培养基采用优化后的培养基配方，可以在很大程度上避免色素的积累。

固体培养基不凝固，是什么原因造成的?

琼脂添加量正确的情况下，培养基不凝固可能是由于灭菌时间过长和pH值偏低造成的。部分地区的水质偏酸，这种情况下，建议调整SD基本培养基的pH值至5.8,YPDA培养基的pH值至6.5,在121℃的条件下，15 min高压灭菌。

用酵母双杂交系统验证有明确报道的有相互作用的蛋白间的作用，结果出现假阴性，一个星期之后还是看不到蓝色菌落，原因是什么?

测不到阳性结果可能存在以下原因：一、研究的存在相互作用的蛋白是跨膜蛋白或分泌到胞外的蛋白，如果存在这种情况，需要将跨膜区或者信号肽序列都去除，因为酵母双杂交系统验证蛋白相互作用是在核内进行的；二、杂交的蛋白在宿主细胞中表达不稳定，GAL4融合区域堵塞了相互作用的位点，杂交蛋白在酵母体内进行了不正确的折叠都会影响到两个蛋白相互作用的验证；三、有研究表明，有些存在弱相互作用的蛋白最长半个月以后才可以看到阳性结果。建议在进行酵母双杂交实验之前对相关的蛋白特性进行分析，或者重复实验进行试验结果的验证。