肝实质细胞是肝功能的基本组成单位，大约占肝脏体积及数量的80%左右，肝实质细胞具有多方面的功能，例如：蛋白质的合成和储存、分泌胆汁和解毒物质等。体外培养的肝实质细胞是研究肝脏能量代谢、物质合成、药理毒性学良好模型。

一、肝脏灌注

1.麻醉并且固定小鼠，酒精喷洒清洗腹部。

2.剪开小鼠腹腔，沿肝脏上方剪开胸腔隔膜，使上腔静脉暴露，用止血钳夹住上腔静脉。

3.拨开小鼠肠组织，暴露小鼠下腔静脉和肝门静脉，在下腔静脉的位置插入静脉留置针并固定好位置，轻轻拔出针芯，拔出时针管处有回血，此时外套软管留在血管内，进行灌注。

4.将装有肝实质灌注液Ⅰ的注射器与静脉留置针相连接，轻轻推动注射器，灌注液 Ⅰ 缓慢灌入，可见肝脏充盈，此时剪开门静脉引流，保持灌流速度在5 mL/min至排尽肝脏内血液、肝组织呈现蜡黄色为止。

5.换上肝细胞灌注液 Ⅱ，低速（3 mL/min）灌流，并节律性挤压门静脉切口（挤压5-10s左右，间隔30s-1min,让肝脏充盈，提高消化率），持续消化5-15min不等，消化肝脏直至用棉签按压肝脏有塌陷感或者部分透明感，条纹样的裂纹。

6.将肝脏沿着膈肌周围整个剪下来，转移到一个装有细胞洗液的培养皿中。在超净台中用镊子去除胆囊和肝脏外的包膜，轻轻抖动组织使肝实质细胞如流沙状流出，未完全分散的部分用镊子轻轻拨散至细胞洗液中。

二、肝实质分离纯化

1.用细胞洗液润洗75 μm筛网，将上述步骤中的培养皿内的细胞浊液用宽头吸头或者巴氏管移至筛网上方过滤。

2.4℃、50 xg离心5分钟。

3.小心弃去上清（低速离心后，肝实质细胞以松散的方式沉在底部，弃上清时切勿吸力过大或者直接倾倒上清），加入15 mL细胞洗液，用宽头吸头或者巴氏管轻轻重悬沉淀。

4.重复步骤2，小心弃去上清，加入4 mL细胞洗液重悬细胞沉淀。

5.依据细胞活率和数量配置8 mL 30%-50%的活细胞纯化液（纯化液浓度越高，得到的肝实质细胞活性越好，但与此同时，得到的细胞数量会减少，需要依据实验进行取舍，如配置30% 细胞纯化液配方为：细胞纯化液：分离纯化稀释液 = 3:7）。将配置好的活细胞纯化液均分至两个15 mL离心管，将细胞悬液分别小心添加至两倍体积的细胞纯化液面上，细胞悬液与细胞纯化液间应产生明显分层。

6.400 x g、4 ℃离心10分钟（使用水平转子，加速度减速度均为最低）。

离心完毕后离心管底部的沉淀即为纯化后的肝实质细胞，用贴壁培养基重悬。

三、肝实质分离纯化

1.肝实质细胞种板前预先用 Ⅰ 型鼠尾胶原蛋白（以下简称鼠尾胶）铺至培养器皿底部包被0.5-2 h（最长不超过6 h），吸尽鼠尾胶，鼠尾胶可回收使用1-2次。

2.使用1 × PBS 清洗皿底后吸去PBS。

3.将细胞悬液按照3 x 105/mL细胞密度铺至鼠尾胶包被的培养器皿中，转移至细胞培养箱中。

4.培养4 h后显微镜下观察，肝实质细胞呈较大圆形、有明显双核结构，将培养器皿内的贴壁培养基更换为维持培养基。

注意事项：

1.肝脏离体后建议在冰上操作，分散肝实质细胞时应避免使用尖头吸头、过度重悬等操作导致细胞机械损伤。

2.肝实质细胞在贴壁2-3天后分化明显，建议在3天内完成实验。

3.肝实质细胞为不可传代细胞，禁止使用胰酶等消化酶处理肝实质细胞。

4.小鼠肝实质灌注液 Ⅱ 中含有微生物生长所需的营养成分，请在超净工作台内打开，按照所需要量分装，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。

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