LIF是如何发现的?

    LIF从发现、克隆到2015年已经有27年的历史了。那么LIF是如何被发现的呢?这要从白血病的治疗说起。
我们知道,正常的血液细胞是终末分化的细胞。存在于骨髓或外周血等处的微量造血干/祖细胞经过增殖和分化后可成为成熟的血液细胞,以不断补充死去的成熟血液细胞。如果造血干/祖细胞的增殖、分化过程受到异常调节,这些细胞将停留在幼稚的细胞阶段,而数目仍在不断增加,这就是白血病的成因。因此,白血病是造血细胞的增殖和分化过程失去正常的控制而形成的。科学家一直在寻找能够促进白血病细胞分化,同时又能抑制其增殖的细胞因子或药物,以期治疗白血病。
    19世纪80年代已发现了一些调节造血细胞增殖和分化的细胞因子,如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子),Multi-CSF(即现在的IL-3)和IFN-γ(干扰素-γ)等。这些细胞因子的共同特点是:既能促进造血细胞的分化,又能刺激它们的增殖。这就带来一个问题,即这些细胞因子在促进白血病细胞分化的同时,也会大量增加白血病细胞的数量,这样可能会加重白血病的病情,而不是治疗白血病。所以,科学家试图仍然需要找到一种只诱导白血病细胞分化,但不促进白血病细胞增殖的细胞因子来治疗白血病。

        

    1969年在从SL品系小鼠的自发髓系白血病体外建系(即后来我们所熟知的小鼠M1髓系白血病细胞系,常用于重组LIF蛋白的生物活性检测)的过程中,研究人员发现,正常细胞的培养液可诱导M1白血病细胞系分化为成熟的巨噬细胞或粒细胞。研究人员将培养液中的这些未知的诱导成分统称为Differentiation Stimulating Factor,即分化刺激因子,简称D-factors (D-因子)。
    1981年年和1984年科学家分别从小鼠Krebs肉瘤细胞和小鼠 L929成纤维细胞的培养液中鉴定出MGI-2(Macrophage and Granulocyte Inducing-2,巨噬细胞和粒细胞诱导-2)和一种D-因子,两者均可诱导小鼠M1髓系白血病细胞的分化,而不刺激正常造血细胞的增殖。
    紧接着在1987年,澳大利亚皇家墨尔本医院沃尔特与伊丽莎医学研究所(Walter and Eliza Hall Institute (WEHI), Royal Melbourne Hospital)的Donald Metcalf实验室从小鼠Krebs肉瘤细胞培养液中分离出可以诱导小鼠M1髓系白血病细胞分化的蛋白,因该蛋白具有抑制M1髓系白血病细胞增殖的作用,因而被命名为白血病抑制因子,即Leukemia Inhibitory Factor (LIF)。同时发现,该蛋白不能刺激正常髓系前体细胞的增殖。 Donald Metcalf等认为LIF与前面所发现的MGI-2和D-因子是同一种物质,因他们最大的共同点是均可诱导小鼠M1髓系白血病细胞向巨噬细胞分化。至此,LIF蛋白被正式发现和命名,MIG-2和D-因子为其别名。随后,Donald Metcalf实验室分别于1987年和1988年克隆出表达小鼠LIF和人LIF的基因。
    LIF的发现似乎给人们治疗白血病带来希望。然而深入的研究发现,LIF的作用非常广泛,即使对于白血病细胞系,也是有些抑制,有些促进。因此,LIF与其它多功能的细胞因子,如TNF-等相似,很难应用于临床。这些年来,LIF颇受关注。血液学家、神经生物学家、肌肉细胞生物学家、骨生物学家、内分泌生物学家和生殖生物学家都在研究LIF,可惜没人能够做深[7]。LIF目前最广泛的应用还是在实验室里用来培养小鼠胚胎干细胞,这在后面会详述。
LIF怎么和小鼠胚胎干细胞的培养联系上的呢?

    LIF因为可抑制小鼠M1白血病细胞的增殖而得名,那么科学家又是如何发现其在mES培养中的重要作用呢?科研充满了巧合,但需要敏锐和发散性的思维去感触这种巧合。
    1981年剑桥大学的Martin Evans,Matthew Kaufman和美国加州大学旧金山分校(UCSF)的Gail Martin等首先从小鼠胚胎内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)中获得小鼠胚胎干细胞(mES)的时候,必须在饲养层细胞(feeder cells)上进行培养,否则mES就会自发分化。
    为分析饲养层细胞抑制mES分化的机制,人们从饲养层细胞的培养上清中分离出能够抑制mES分化的成分[10,11]。但这些成分的抑制分化作用均弱于英国爱丁堡大学医学院(University of Edinburgh Medical School)的Austin Smith于1986年从Buffalo大鼠肝脏细胞培养上清中分离出来的DIA(differentiation-inhibiting activity),即分化抑制活性蛋白[12]。后来,Austin Smith转到英国牛津大学工作,并继续研究DIA。1988年与美国Genetics Institute公司合作,Austin Smith在探讨DIA是否可作用于ES细胞以外的细胞时,发现DIA能够维持DA-1a (小鼠IL-3依赖的白血病细胞系)的持续生长。凑巧的是,美国Genetics Institute公司新近刚克隆出一个能维持DA-1a细胞生长的造血生长因子基因,命名为HILDA(Human Interleukin for DA cells)。更重要的是,序列分析发现,HILDA基因与澳大利亚Donald Metcalf实验室于同一年刚刚克隆出来的人LIF(hLIF)基因[6]序列一致,也就是说HILDA就是LIF。美国Genetics Institute公司的这两个工作连续发表在Nature杂志1988年的同一期中。

    鉴于DIA和HILDA/LIF均能够维持DA-1a的生长,Austin Smith就在想,HILDA/LIF是否也能和DIA一样能够抑制mES的分化。结果是令人振奋的!即将HILDA/LIF基因克隆进入非洲绿猴COS肾细胞中进行表达,COS细胞的培养上清可抑制mES细胞的分化。而且,考虑到DIA蛋白与HILDA/LIF蛋白的分子量也相近。因此推测,DIA应该就是LIF。
    上面的研究最重要的是发现了LIF可能就是能够抑制mES分化的DIA,也揭示了LIF对不同细胞系具有不同的作用,甚至是截然相反的作用。对小鼠M1白血病细胞,LIF可促进其分化,而对于mES,LIF则抑制其分化。
    估计国外科学家之间的沟通是非常多和及时的。同期,发现小鼠和人LIF的澳大利亚Donald Metcalf实验室也敏锐地意识到DIA与LIF的相似性,并证实LIF(无论是人LIF,还是小鼠LIF)能维持mES的未分化状态[15],该研究结果与美国Genetics Institute公司的两个工作发表在1988年Nature杂志的同一期上。也就是说,Nature杂志1988年的同一期连续刊登了3篇关于LIF的文章,且都是讲LIF与mES细胞培养的关系,可见LIF在mES细胞培养中的重要性。
    因此在1988年底,也就是人的LIF刚刚被克隆出来的时候,人们就将目光转向了LIF在mES培养中的作用。此后,没人再去验证DIA与LIF是否真为同一种物质,因只要得到了一种能够强力抑制mES分化的因子(即LIF)就足够了。